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    流式抗體的選擇使用及注意事項

    發(fā)布時間: 2021-10-28  點擊次數(shù): 5511次

    流式抗體的選擇:


    1、流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇基本的條件:目標(biāo)蛋白特異性,反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實驗。

    2、流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實驗過程中,盡量減少實驗工序和過程,以保證實驗的真實和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實驗而不去做間接標(biāo)記。


    3、流式抗體熒光標(biāo)記的選擇:如果實驗中檢測單一指標(biāo):不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。FACS Calibur儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常來說,PE*,適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱,適用于強(qiáng)表達(dá)抗原,使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時檢測多個指標(biāo):確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道:流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如:實驗者同時檢測三個指標(biāo),可以在圖1中綠色、和紅色三個通道中各選一個適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記,F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個通道的熒光標(biāo)記,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響后結(jié)果。因此,流式細(xì)胞儀的通道越多,同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

    抗體

    同型對照的選擇:
    流式細(xì)胞實驗和其他抗體相關(guān)實驗有點不同的就是需要選擇同型對照。同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色,相當(dāng)于實驗的陰性對照。同型對照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源,同亞型,同熒光標(biāo)記的抗體。比如:抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體,小鼠的IgG2a。同型對照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a。

    流式抗體的選擇使用注意事項:


    1、建議實驗細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實驗結(jié)果受影響,因此需要優(yōu)化試驗條件。注:不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異,例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個細(xì)胞為起始上樣量,抗體用量為10μl,而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個細(xì)胞,抗體用量減少到5μl。


    2、 直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存,不要冷凍。


    3、 盡量選擇經(jīng)實驗驗證的流式抗體,以保證實驗結(jié)果。
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